Entwicklung und Evaluierung von PCR-Methoden zum Nachweis vom Coccidioides posadsaii ; Development and evaluation of PCR methods for detection of Coccidioides posadasii

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer molekularbiologischen Methode zum spezifischen Nachweis von DNA des dimorphen Pilzes Coccidioides posadasii. Er verursacht die ausschließlich auf dem amerikanischen Kontinent in wüstenartigen Regionen endemische Kokzidioidomykose. Die Diagnostik dieser gelegentlich nach Europa importierten Systemmykose beschränkt sich auf immundiagnostische Tests und die Erregeranzucht. Neben der mäßigen Sensitivität dieser Verfahren ist die Kultur noch dadurch limitiert, dass C. posadasii ausgesprochen infektiös ist und die Anzucht auf Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 beschränkt ist. Grundvoraussetzung für die Entwicklung einer PCR war daher der Nachweis dass die angewandte Methode nicht nur erfolgreich DNA extrahiert sondern auch, dass das Probenmaterial sicher nicht mehr infektiös ist. Es wurden Suspensionen von 10 verschiedenen C. posadasii-Stämmen unter entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen hergestellt und nach einem modifizierten kommerziellen DNA-Extraktionsprotokoll bearbeitet. Zur Zerstörung der Pilzzellwände wurden drei Zyklen bestehend aus Einfrieren in Flüssigstickstoff und Kochen eingefügt. Die parallel bearbeiteten Suspensionen wurden nach jedem Schritt erneut kultiviert, um die Vitalität und damit die Infektiösität nachzuweisen resp. auszuschließen. Pilze waren nur aus unbehandelten Suspensionen wieder anzüchtbar, während alle anderen Kulturen steril blieben. Damit gelang der Nachweis, dass mindestens drei Schritte des Extraktionsprotokolls jeweils alleine bereits ausreichend sicher die Infektiösität der Proben eliminieren. Daraufhin wurde die DNA aus 120 klinischen Isolaten von C. posadasii aus dem Endemiegebiet in Monterrey in Mexiko nach diesem Protokoll extrahiert. Zusätzlich wurden Gewebeproben untersucht, in denen entweder mikroskopisch eine Kokzidioidomykose diagnostiziert oder eine andere Systemmykose identifiziert worden war. Für die in dieser Arbeit entwickelten PCR-Verfahren wurde die Zielsequenz in einem Gen gewählt, welches für das ...